生物化學(xué)與醫(yī)學(xué)研究
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究：氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，檢測(cè)蛋白質(zhì)中的氨基酸序列和比例對(duì)于理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用至關(guān)重要。
疾病診斷與治療：異常的氨基酸代謝可能與多種疾病有關(guān)，如遺傳性代謝疾病、神經(jīng)退行性疾病、肌肉疾病等。氨基酸檢測(cè)可以幫助早期診斷和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，指導(dǎo)個(gè)性化治療。
食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)
食品質(zhì)量與安全：氨基酸檢測(cè)是評(píng)估食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)鍵，特別是對(duì)于蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的評(píng)價(jià)。確保食品中必需氨基酸的充足供給對(duì)于維持人體健康至關(guān)重要。
食品加工與儲(chǔ)存：監(jiān)測(cè)食品加工和儲(chǔ)存過(guò)程中氨基酸的變化，可以評(píng)估食品的新鮮度和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，預(yù)防食品安全問(wèn)題。
制藥工業(yè)
藥物研發(fā)與質(zhì)量控制：在藥物合成和蛋白質(zhì)工程中，氨基酸檢測(cè)是確保藥物活性、純度和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。
臨床營(yíng)養(yǎng)支持：在重癥監(jiān)護(hù)和特殊醫(yī)療條件下，精確的氨基酸檢測(cè)可以幫助制定個(gè)性化的營(yíng)養(yǎng)支持方案，滿足患者特定的代謝需求。
農(nóng)業(yè)與植物科學(xué)
作物營(yíng)養(yǎng)與改良：檢測(cè)植物組織中的氨基酸組成，有助于理解作物的營(yíng)養(yǎng)需求，指導(dǎo)肥料施用和作物改良。
生物技術(shù)與育種：在轉(zhuǎn)基因作物和植物基因工程中，氨基酸檢測(cè)可以評(píng)估基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能，推動(dòng)作物抗逆性和產(chǎn)量的提升。
環(huán)境監(jiān)測(cè)與生態(tài)學(xué)
生態(tài)過(guò)程與生物標(biāo)志物：在環(huán)境樣品中檢測(cè)特定氨基酸，可以作為生物活性和生態(tài)過(guò)程的指示劑，如微生物代謝、生物降解和生態(tài)健康評(píng)估。
檢測(cè)指標(biāo)
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指標(biāo)
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方法
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標(biāo)準(zhǔn)
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樣品要求
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用量/g
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水解氨基酸組分
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丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸、賴氨酸
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高效液相色譜法
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付迪,沈艷紅,宛燕飛,張力,徐志珍,張文清,夏瑋.OPA-FMOC在線柱前衍生化HPLC法測(cè)定甘露聚糖肽中氨基酸組成及含量
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鮮樣/烘干樣
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0.5
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液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
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趙文琦,夏菲,第五文博等.5種高山蔬菜的氨基酸含量分析及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)
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游離氨基酸組分
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丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、賴氨酸、?；撬?/span>
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高效液相色譜法
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衛(wèi)陽(yáng)飛,宋海,岳國(guó)仁,張宏曦,李彩霞.6種葡萄籽中水解氨基酸和游離氨基酸含量測(cè)定及比較[J].食品與機(jī)械,2018,34(09):77-82.
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液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
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趙文琦,夏菲,第五文博等.5種高山蔬菜的氨基酸含量分析及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)
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高效液相色譜法檢測(cè)氨基酸組分
基本原理
高效液相色譜法（HPLC）是一種用于分離、鑒定和定量液體中半揮發(fā)和不揮發(fā)化合物的分析技術(shù)。在氨基酸的分析中，HPLC通常采用前柱衍生化方法，將氨基酸與衍生劑反應(yīng)生成具有熒光或紫外吸收性能的化合物，以增加其檢測(cè)靈敏度。HPLC系統(tǒng)由溶劑泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，通過(guò)控制流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸的分離和定量。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
HPLC測(cè)定氨基酸具有高分辨率、高靈敏度和高效率等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。它可以用于分析不同來(lái)源的氨基酸，評(píng)估蛋白質(zhì)質(zhì)量和純度，監(jiān)測(cè)氨基酸代謝變化以及研究蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)等。HPLC測(cè)定氨基酸的準(zhǔn)確性和精密度對(duì)于保證生物藥物質(zhì)量的合規(guī)性具有重要意義。
流程概述
樣品前處理
蛋白質(zhì)水解：樣品中的蛋白質(zhì)需先通過(guò)酸水解、堿水解或酶水解等方法轉(zhuǎn)化為自由氨基酸。
衍生化：氨基酸本身在HPLC檢測(cè)中可能沒(méi)有足夠的檢測(cè)信號(hào)，因此通常需要進(jìn)行衍生化處理，將氨基酸轉(zhuǎn)化為有更強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的衍生物。常用的衍生化方法包括熒光衍生化和柱前衍生化。
HPLC分離
色譜柱選擇：選擇適合氨基酸分離的色譜柱，如反相柱（C18）、離子交換柱或?qū)榘被岱治鲈O(shè)計(jì)的柱子。
流動(dòng)相：使用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)作為流動(dòng)相，通過(guò)梯度洗脫來(lái)優(yōu)化不同氨基酸的分離效果。流動(dòng)相的pH值和組成（如水和有機(jī)溶劑的比例）需精心調(diào)整。
分離過(guò)程：氨基酸樣品在高壓下通過(guò)色譜柱，根據(jù)它們與固定相的相互作用力（如疏水性、離子交換能力等）不同而被分離。
檢測(cè)與定量
檢測(cè)器：常用的檢測(cè)器包括紫外/可見(jiàn)光吸收檢測(cè)器（UV/Vis）、熒光檢測(cè)器（FLD）、電導(dǎo)檢測(cè)器（CD）或質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）。選擇哪種檢測(cè)器取決于氨基酸的衍生化方式和檢測(cè)需求。
定量分析：通過(guò)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液進(jìn)行比較，根據(jù)峰面積或峰高進(jìn)行定量分析。有時(shí)會(huì)結(jié)合校準(zhǔn)曲線以提高定量的準(zhǔn)確性。
數(shù)據(jù)處理
結(jié)果分析：利用HPLC系統(tǒng)的軟件分析數(shù)據(jù)，確定各氨基酸的保留時(shí)間，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，進(jìn)行定性鑒定和定量計(jì)算。
報(bào)告生成：整理分析結(jié)果，形成詳細(xì)的檢測(cè)報(bào)告，包括氨基酸種類(lèi)、濃度及可能的變異分析。
注意事項(xiàng)
梯度洗脫：對(duì)于復(fù)雜樣品，可能需要使用梯度洗脫程序，以優(yōu)化分離效果。
重復(fù)性和穩(wěn)定性：確保實(shí)驗(yàn)條件的重復(fù)性和色譜柱的穩(wěn)定性，以獲得可靠的數(shù)據(jù)。
樣品保存：樣品在分析前需妥善保存，避免氨基酸的降解或轉(zhuǎn)化，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氨基酸組分
液相色譜（LC）分離原理
液相色譜是基于不同氨基酸在固定相和流動(dòng)相之間的分配差異來(lái)進(jìn)行分離的。在LC系統(tǒng)中，樣品通過(guò)高壓泵送入色譜柱，柱內(nèi)填充有特定的固定相（如反相柱或離子交換柱），流動(dòng)相（如含有緩沖鹽的有機(jī)溶劑）攜帶樣品通過(guò)色譜柱。由于氨基酸與固定相的相互作用不同，它們會(huì)在柱中以不同的速度移動(dòng)，最終根據(jù)保留時(shí)間的不同被分離出來(lái)。
質(zhì)譜（MS）檢測(cè)原理
分離后的氨基酸通過(guò)接口進(jìn)入質(zhì)譜儀，通常使用電噴霧電離（ESI）或大氣壓化學(xué)電離（APCI）將氨基酸分子轉(zhuǎn)化為帶電離子。這些離子隨后進(jìn)入質(zhì)量分析器，如四極桿、飛行時(shí)間或離子阱等，根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離。在第一級(jí)質(zhì)譜（MS1）中，所有離子按照m/z值被分離和檢測(cè)。在第二級(jí)質(zhì)譜（MS2）中，選擇特定的母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID），產(chǎn)生子離子，通過(guò)監(jiān)測(cè)特定的子離子（即多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，MRM模式），可以實(shí)現(xiàn)高度選擇性和靈敏度的檢測(cè)。
衍生化
為了提高氨基酸在LC-MS/MS中的檢測(cè)靈敏度和選擇性，通常需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化處理。衍生化可以使氨基酸轉(zhuǎn)化為更易于電離的化合物，從而改善檢測(cè)信號(hào)。常見(jiàn)的衍生化方法包括熒光衍生化和柱前衍生化，這些方法可以增加氨基酸的檢測(cè)響應(yīng)，提高分析的準(zhǔn)確性和可靠性。
流程概述
樣品前處理
蛋白質(zhì)水解：如果樣品中含有蛋白質(zhì)，首先需要通過(guò)酸水解、堿水解或酶水解將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為自由氨基酸。
衍生化：為了提高檢測(cè)靈敏度和選擇性，通常需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化處理，將它們轉(zhuǎn)化為更易于檢測(cè)的形式。常用的衍生化方法包括熒光衍生化和柱前衍生化。
液相色譜分析
色譜柱選擇：選擇合適的色譜柱，如反相色譜柱或?qū)Ｓ玫陌被岱治鲋?，以?shí)現(xiàn)良好的分離效果。
流動(dòng)相選擇：根據(jù)衍生化后的氨基酸性質(zhì)，選擇最適流動(dòng)相，通常包含緩沖鹽和有機(jī)溶劑，以確保良好的分離和檢測(cè)。
質(zhì)譜分析
電離模式：選擇合適的電離模式，如電噴霧電離（ESI）或大氣壓化學(xué)電離（APCI），以獲得最佳的離子化效率。
多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式：在MS/MS中，通過(guò)選擇性監(jiān)測(cè)特定母離子和子離子的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）過(guò)程，實(shí)現(xiàn)高度選擇性和靈敏度的檢測(cè)。
數(shù)據(jù)分析
定性分析：通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較，確認(rèn)樣品中氨基酸的種類(lèi)。
定量分析：使用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)或標(biāo)準(zhǔn)曲線法，結(jié)合特征離子對(duì)的強(qiáng)度，計(jì)算樣品中氨基酸的濃度。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
高靈敏度：LC-MS/MS能夠檢測(cè)極低濃度的氨基酸，適用于痕量分析。
高選擇性：通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，能夠排除基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)高度選擇性的檢測(cè)。
多組分同時(shí)分析：LC-MS/MS能夠同時(shí)檢測(cè)多種氨基酸，提高分析效率。
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